AI+Biotech | 联合免疫治疗新探索

2022年6月7日，西湖云谷智药创始团队成员在《核酸研究》 Nucleic Acids Research在线发表题为“An in-library ligation strategy and its application in CRISPR/Cas9 screening of high-order gRNA combinations”的论文。

基于CRISPR基因编辑技术，该研究开发了一种能在单一反应中、按预先设定的程序，配对连接上万条不同核酸序列的技术，实现了对多基因组合的高通量筛选。

[ 背景解读 ]

复杂生物的细胞表型常由多个基因联合作用产生，如多组转录因子相互作用会促进癌症的侵袭-转移；又如阻断单一受体不足以保护宿主细胞免受感染等。近年来，联合免疫疗法正在尝试同时靶向多个不同功能的免疫抑制蛋白来增强免疫细胞的抗肿瘤能力，并取得不错的进展。例如，在黑色素瘤和非小细胞肺癌的临床试验中，联合PD-1阻滞剂和CTLA-4阻滞剂治疗较使用单一阻滞剂显著地延长了受试患者的生存期。

In-library Ligation的设计核心在于结合了生物信息学序列设计和对分子生物学切口酶的灵活应用，能够在文库中的DNA片段上，构建出具有足够复杂度的超长粘性末端，使得成千上万的片段能够在一个反应体系中以预先设计好的顺序和组合精准配对。研发团队首先将In-library Ligation技术应用于构建CRISPR筛选文库，并用经典的Jurkat细胞体外激活实验验证了该技术在CRISPR文库筛选中的可行性。

随后，研发团队使用动物体内肿瘤杀伤模型，筛查能在肿瘤内增强免疫细胞活性的基因编辑策略。实验结果显示，当T细胞被同时敲除了Pdcd1、 Adora2a和CTLA-4（简称PAC）三个免疫检查点基因后，它们在肿瘤内表现出了更强的活性。在验证实验中，在联合敲除PAC基因后（红色线条组），T细胞较对照组（黑色、蓝色和绿色线条组）表现出更强的控制肿瘤大小的能力，并延长了荷瘤小鼠的生存期。

In-library Ligation技术为高通量、高复杂度、可控的DNA片段连接提供了解决方案，可应用于CRISPR文库构建、长片段DNA文库合成等应用场景。通过In-library Ligation构建CRISPR文库筛选出的PAC组合，为靶向多个免疫检查点的联合免疫治疗、构建增强型CAR-T细胞提供了新思路。